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Aus dem Alltag in einem Labor für Gendiagnostik: Mutationen auf den Grund gehen


Equimondi PROfessional Pferd - epaper ⋅ Ausgabe 3/2019 vom 01.07.2019

Als Züchter studiert man sorgfältig die Pedigrees und versucht, die beste Zuchtlinie zu finden, die die Talente der Stute ergänzt. Man schaut sich Videos von den Prüfungen an, geht zu den Hengstpräsentationen und entscheidet sich schließlich für den perfekten Hengst für die Stute.


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@@In Züchterkreisen hat das WFFS (Warmblood Fragile Foal Syndrome) für Angst und Schrecken gesorgt. Ein Gentest weist bei einem entsprechenden Verdacht nach, ob das Fohlen erkrankt ist.


Alle Fotos: Dr. Melissa Cox

Die Stute wird gedeckt und wird tragend – jetzt geht es nur noch darum, die elf Monate auf die Geburt des Fohlens zu ...

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Die Stute wird gedeckt und wird tragend – jetzt geht es nur noch darum, die elf Monate auf die Geburt des Fohlens zu warten. In dieser eigentlich ruhigen Wartezeit wird der Züchter jedoch auf ein neues Problem in der Welt der Warmblutpferde aufmerksam. Eine genetische Krankheit namens „Warmblood Fragile Foal Syndrom (WFFS)“ hat die Runde gebracht, und das klingt wichtig. Noch wichtiger erscheint dies, als bekannt wird, dass der Hengst, mit dem die Stute verpaart wurde, positiv als Träger für WFFS getestet wurde. Was bedeutet das für die Stute und das Fohlen?
Der Züchter schickt Haare von der Stute zum Labor für einen Gentest und hofft auf das Beste.

Aber was passiert in einem solchen Labor eigentlich?
Aber was passiert in einem solchen Labor eigentlich? Für den Außenstehenden sind das Labor und seine Prozesse eine „Black Box“ – welche Magie geht im Inneren vor sich? Was passiert zwischen dem Senden der Haare und dem Erhalt des Ergebniszertifikats?
Wie kann der Züchter sicher sein, dass der Test an der richtigen Probe durchgeführt wird, dass der Test zuverlässig ist, dass die Ergebnisse tatsächlich etwas bedeuten?
In diesem Artikel versuchen wir, Ihnen einen Einblick in diese „Black Box“ zu geben und laden Sie mit uns in das Gen-Testlabor ein. Vorweg sei gesagt: Es gibt keine Magie, sondern viel Wissenschaft und sehr detaillierte Verfahren, um sicherzustellen, dass jeder Schritt richtig gemacht wird.
Wenn eine Probe für einen Gentest im Labor eintrifft, durchläuft sie eine Vielzahl an Qualitätskontrollschritten (QC).

QC1: Begutachtung des Probenmaterials
Das eingesendete Probenmaterial wird begutachtet: Ist die Probe geeignet und in ausreichender Menge für den Test vorhanden?
Für unser Bespiel: Ja, der Züchter hat genug Haare mit Wurzeln von der Stute eingesendet.

QC2: Prüfung der Formulare
Die eingereichten Formulare werden überprüft: Sind die Angaben im Auftrag vollständig? Ist der gewünschte Test für die Rasse sinnvoll?
Überprüfung von spezifischen Anforderungen: Sind zusätzliche Unterlagen erforderlich? Wenn das Testergebnis von Zuchtverbänden anerkannt werden soll, erfordert dies z.B. oft eine Bestätigung der Identität des Tieres bei der Probenentnahme durch einen Tierarzt/ Vertreter des Zuchtbuches. Erfüllt die Probe die Kriterien, so wird eine eindeutigen Proben ID vergeben und die Probe an das Labor übergeben.
Für unser Bespiel: Die Stute ist als Warmblut angegeben, also macht der WFFS Test Sinn. Der Züchter hat die Haarprobe von einem Tierarzt nehmen lassen. Dieser hat die Identität bestätigt und die Ergebnisse sind damit offiziell.

QC3: DNA Isolierung und Qualitätskontrolle
Die Bearbeitung der Probe im Labor erfolgt größtenteils voll automatisiert. Als erstes wird aus den Haarwurzeln die DNA des Pferdes isoliert und aufgereinigt. Die DNA wird beurteilt: Sind Menge und Qualität ausreichend für die Analyse?
Für unser Bespiel: Die aus dem Haar der Stute isolierte DNA ist von hoher Qualität und es ist genug vorhanden, die Analyse kann weiter gehen.
Im Folgenden wird die Analyse einer Probe am Beispiel der Sanger-Sequenzierung beschrieben (weitere Methoden vgl. Info Box): Ein kleiner DNA Abschnitt, in dem die Mutation auftritt, wird mithilfe der so genannten Polymerase -Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Parallel dazu wird mit einer Positiv-Kontrolle (Probe mit bekanntem Genotyp) und einer Negativ-Kontrolle (keine DNA) genauso verfahren. Eine kleine Menge der vervielfältigten DNA-Fragmente (PCR-Produkte) wird anschließend in einem Agarose-Gel der Größe nach aufgetrennt (Agarose-Gelelektrophorese).

QC4: Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese ermöglicht, die DNA-Produkte auf ihre Größe hin zu überprüfen (testspezifisch). Auf dem Gel ist die DNA in Form einer „Bande“ zu sehen. Eine solche Bande ist für die zu testende Probe und die Positiv-Kontrolle zu erwarten. Die Negativ-Kontrolle darf keine Bande zeigen. Wäre dies der Fall, so weißt dies auf eine Kontamination mit DNA hin und die PCR muss mit neuen Reagenzien wiederholt werden. Mithilfe der Kontrollen lässt sich sicherstellen, dass der Assay korrekt funktioniert.
Für unser Bespiel: Die „Bande“ der DNA-Fragmente aus der PCR hat die richtige Größe und es gibt keine Kontamination in der Negativkontrolle, es kann also weiter gehen.

QC5: Sequenzierung
Entsprechen die Banden im Gel der erwarteten Größe, so werden die PCR-Fragmente mittels Sanger-Sequenzierung sequenziert. Dabei werden in einer PCR unter anderem mit fluoreszierenden Markern versehene Nukleotide eingesetzt. Anschließend werden die Produkte dieser PCR in Kapillaren der Größe nach aufgetrennt (Kapillarelektrophorese). Mit einem Laser werden die fluoreszenzmarkierten Nukleotide angeregt und die Signale von einem Detektor erfasst. Dies liefert die genaue Abfolge der DNA-Basen des mittels PCR vervielfältigten DNA-bschnitts.
Die Sequenz wird am Computer gegen eine bekannte Referenz abgeglichen. So lässt sich im direkten Vergleich feststellen, ob eine Veränderung (Mutation) in der DNA-Sequenz der Probe vorliegt. Das Ergebnis wird im System gespeichert und das Zertifikat über den Gentest des Pferdes wird erstellt.
Ist die Qualität der Sequenz nicht ausreichend um den Genotyp eindeutig zu bestimmen, wird der Test wiederholt.
Für unser Bespiel: Die DNA Sequenz der Stute ist von sehr guter Qualität und einfach zu analysieren. Bei der WFFS Mutation ist eine einzelnes Basenpaar vertauscht, Guanin (G) wird mit Adenin (A) ersetzt. Die Stute zeigt diese Mutation nicht.

QC6: Finaler Check
Vor dem Versenden werden die Zertifikate noch ein letztes Mal geprüft: Sind alle Daten korrekt? Ist dies der Fall geht das Zertifikat an den Besitzer. Das Zertifikat wird in unserem Fall vom Züchter gespannt geöffnet, und die Erleichterung ist groß beim Lesen der Ergebnisse: Die Stute ist kein Träger für WFFS.
Da WFFS rezessiv ist, bräuchte das Fohlen zwei Kopien der Mutation, eine von der Mutter und eine vom Vater. Das Fohlen hat eine 50%ige Chance hat, die WFFS-Mutation von seinem Vater zu bekommen, aber nicht von der Mutter, da sie keine Trägerin ist. Es gibt also keine Chance, dass es von der Krankheit betroffen ist. Der Züchter kann beruhigt sein. Er versteht den Testprozess und kann sich auf die Qualität des Tests und der Ergebnisse verlassen. Das Fohlen wird nach der Geburt getestet, um herauszufinden, ob es ein Träger ist, also die Mutation vom Vater geerbt hat. Wenn es sich bei dem Fohlen um einen Träger handelt, kann der Züchter einen Nicht-Trägerpartner wählen, wenn er es für die Zucht verwendet möchte.

Wie wird ein Gentest für Pferde entwickelt und validiert?
Für die Entwicklung eines neuen genetischen Tests wird in der Regel das genetische Material von zwei Gruppen von Pferden – solchen mit dem spezifischen Merkmal und solchen ohne das Merkmal – miteinander verglichen. Gibt es beispielsweise aus früheren Forschungsergebnissen oder anderen Spezies mit einem vergleichbaren Merkmal Hinweise auf ein die Beteiligung eines bestimmten Gens, so können diese ausgewählten Gene gezielt betrachtet werden. Gibt es keinen konkreten Anhaltspunkt so kann das gesamte Genom analysiert werden, um Regionen zu identifizieren, in denen sich die beiden Gruppen voneinander unterscheiden. Ist das Merkmal gut beschrieben und charakterisiert, so kann die Identifizierung der ursächlichen Mutation sehr einfach sein.
Spielen dagegen mehrere genetische Varianten oder zusätzliche äußere Faktoren, wie z.B. Umweltbedingungen für die Ausprägung des Merkmals / den Ausbruch der Erkrankung eine Rolle, so ist es deutlich schwieriger einen Gentest zu entwickeln.
Jedes Tier hat tausende Mutationen, von denen nur eine sehr kleine Anzahl äußerlich erkennbar ist oder Probleme verursacht. Die meisten Mutationen sind gutartig und haben keinerlei Auswirkung auf die Struktur eines Proteins oder die Aktivität eines Gens. Daher müssen die Mutationen stets sehr sorgfältig charakterisiert werden, um herauszufinden, welche dieser vielen natürlich vorkommenden Varianten im Genom tatsächlich das Merkmal/ die Krankheit verursacht.

Faktoren, die die Identifikation ursächlicher Mutationen beeinflussen:
Befindet sich die Mutation in einem Teil des Genoms, der für ein Protein codiert, so kann das betreffende Protein dahingehend untersucht werden, wie sich die Veränderung in der Gensequenz auf die Struktur und Funktionalität des Proteins auswirkt. Ist die gleiche Art von Mutation in anderen Spezies (z.B. Mensch, Maus, Hund, etc.) bekannt, und verursacht einen ähnlichen Phänotyp/ ein ähnliches Krankheitsbild, so ist dies ein sehr guter Hinweis darauf, dass diese Mutation im Pferd eine vergleichbare Wirkung hat.
Etwas komplizierter ist die Entwicklung eines Gentests in folgenden Situationen:
Es kann vorkommen, dass mehrere Krankheiten zwar durch verschiedene Mutationen ausgelöst werden, sich aber in sehr ähnlichen Symptomen äußern. Hier sind äußerst umfassende Forschungsarbeiten notwendig um die verschiedenen Mutationen zu identifizieren und den verschiedenen Subtypen der Erkrankung zuordnen zu können.
Des Weiteren gibt es Krankheiten die erst durch eine Kombination von genetischen „Risikovarianten“ zum Ausbruch kommen. Hat ein Pferd nur eine dieser Varianten, so ist es klinisch gesund. Erst wenn ein Pferd mehrere solcher Risikovarianten hat, ist auch das Risiko erhöht, dass das Pferd erkrankt.
Außerdem gibt es viele Krankheiten, die multifaktorieller Natur sind. Das heißt, eine Kombination aus Genetischen- und Umweltfaktoren führt dazu, dass die Krankheit ausbricht.
Ein Beispiel für eine multifaktorielle Erkrankung ist PSSM2, die in der letzten Ausgabe von ProfessionalPferd vorgestellt wurde.

Nachdem eine bestimmte Mutation in einer kleinen Gruppe von Pferden mit dem Merkmal identifiziert wurde, testen Wissenschaftler weitere Pferde mit dem Merkmal sowie Pferde, die das Merkmal nicht haben. Das Ziel ist zu sehen, ob der Test aussagekräftig ist: Dafür muss der Test die Mutation zuverlässig bei den meisten Pferden mit dem Merkmal (oder zumindest einer klar abgrenzbaren Untergruppe) nachweisen. „Normale“ Pferde – die das Merkmal nicht haben – sollten sich im Test negativ für die Mutation zeigen.
Trifft dies zu, so wird eine noch größere Anzahl, zufällig gewählter Pferde aus unterschiedlichen Rassen getestet, um zu ermitteln, wie häufig die Mutation in der allgemeinen Population vorkommt. Ist die Mutation rassespezifisch oder weit verbreitet? Die Untersuchungen hierzu erstrecken sich oft über viele Jahre. Sind die Forschungsarbeiten abgeschlossen, so werden die Daten in einem wissenschaftlichen Journal (engl.peer-reviewed journal) publiziert. In diesem Rahmen beschreiben die Wissenschaftler das Merkmal und die Mutation und zeigen mit Ihren Forschungsergebnissen, warum die Mutation mit dem Merkmal in Verbindung steht.
In der nächsten Ausgabe von PROfessional Pferd werden wir einen Artikel über WFFS veröffentlichen. Sie erfahren, wann und wie die Krankheit entdeckt wurde, warum sie so lange unbemerkt blieb, was getan werden kann, damit keine betroffenen Fohlen geboren werden und warum Träger weiterhin in Zuchtprogrammen eingesetzt werden sollten. Hinweis – Gentests sind ein Teil des Ganzen.

Wie wirken sich Mutationen aus? – Beispiel Fellfarben
Autosomal dominant:
Bereits eine Kopie der Mutation ist ausreichend, damit das Pferd das Merkmal hat.
Beispiel Tobiano: Pferde mit einer Kopie (n/T) oder zwei Kopien (T/T) der Mutation für Tobiano haben das Tobiano-Scheckenmuster.

Autosomal rezessiv:
Zwei Kopien der Mutation sind notwendig, damit das Pferd das Merkmal hat.
Beispiel Fuchs/Extension: Pferde mit zwei Kopien der Mutation (e/e) haben die Grundfarbe Fuchs. Pferde, die nur eine Kopie (E/e) der Mutation haben, sind Träger. Sie können die Mutation an die Nachkommen weitergeben, haben selbst aber nicht die Farbe Fuchs. (WFFS ist eine autosomal-rezessive Krankheit).

Autosomal semidominant:
Eine Kopie einer Mutation führt bereits zur Ausprägung des Merkmals. Zwei Kopien führen zu einer noch stärkeren Ausprägung.
Beispiel Cream: Pferde mit der Grundfarbe Fuchs (e/e) mit einer Kopie Cream (n/Cr) haben eine aufgehellte Fellfarbe → Palomino. Pferde mit der Grundfarbe Fuchs (e/e) mit zwei Kopien Cream (Cr/Cr) zeigen eine noch stärker aufgehellte Fellfarbe → Cremello.

Phänokopien:
Mutationen im gleichen oder in verschiedenen Genen können zu sehr ähnlichen Phänotypen führen. Zum Beispiel liegen die Cream-, Pearl- und Sunshine-Mutationen alle im SLC45A2-Gen. Die Cream-Mutation ist autosomal semidominant. Pearl und Sunshine sind beide autosomal rezessiv.
Pferde mit einer Kopie der Cream-Mutation in Kombination mit einer Kopie der Sunshine-Mutation (Cr/sun) oder einer Kopie der Pearl-Mutation (Cr/ prl) sind optisch nicht von Pferden mit 2 Kopien der Cream-Mutation (Cr/Cr) zu unterscheiden.

Multifaktoriell:
Ein Merkmal, das erst durch eine Kombination aus genetischen Faktoren (Mutation) und Umweltfaktoren (zB. Fütterung, Haltung, etc.) verursacht wird.
Beispiel „Ausbleichen“ von Rappen: Die dunkle Fellfarbe von Rappen bleicht unter Einwirkung starker Sonnenstrahlung häufig aus. Dieser Effekt ist meist besonders deutlich, wenn das Pferd zusätzlich eine Kopie der nd1-Mutation hat. Auch ein Mangel an Mineralien kann Ausbleichen begünstigen.

Polygenetisch:
Ein Merkmal, dessen Ausprägung von mehreren Genen beeinflusst wird.
Beispiel „Volltiger“/„Near Leopard“: Ein Pferd mit dem Scheckenmuster „Volltiger“ oder „Near Leopard“ entsteht, wenn das Pferd eine Kopie des Tigerschecken-Komplexes (n/LP) und zusätzlich eine oder zwei Kopien der Mutation für Pattern-1 (n/PATN1, PATN1/PATN1) hat.

Was ist eine Mutation (genetische Variante)?
Die spezifische Reihenfolge der DNA-Basenpaare (Sequenz) bestimmt die „Bedeutung“ der DNA. Mutationen sind wie Tippfehler, eine Veränderung in der Sequenz – die Wirkung kann variieren!

Autosomal
Man spricht von einer autosomalen Mutation, wenn die Mutation auf einem Chromosom liegt, dass kein Geschlechtschromosom ist.

Direkter und indirekter Nachweis von Mutationen:
Die meisten Gentests basieren auf dem direkten Nachweis der für ein Merkmal ursächlichen Mutation. Ein anderer Ansatz ist der Nachweis einer mit dem Merkmal assoziierten Mutation, die selbst aber nicht ursächlich ist. Es kann vorkommen, dass sich eine solche „Verlinkung“ von Merkmal und assoziierter Mutation im Rahmen der Vererbung aufhebt. Der Test würde dann ein falsches Ergebnis liefern.

Verschiedene Methoden der DNA-Analyse
Für den Nachweis von Mutationen gilt die Sanger-Sequenzierung als Goldstandard.
Bei dieser Methode wird mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine kleine Region der DNA vervielfältigt, in der die Mutation auftritt. Anschließend wird diese ganze Region sequenziert.
PCR basierte Methoden (Quantitative PCR (qPCR), Kompetitive-Allel-spezifische PCR (KASP) etc.) vervielfältigen direkt den Bereich, der die Mutation enthält und detektieren während dieses Vorgangs, ob eine bestimmte Mutation vorhanden ist, ohne den Bereich im Anschluss zu sequenzieren.
„Chip“- oder „Beadchip“-basierte Methoden nutzen auf einer Oberfläche fixierte kurze DNA-Abschnitte, von denen ein Teil der Sequenz mit der Mutation und ein Teil der Sequenz ohne der Mutation entspricht. Wird nun die zu testende DNA zugegeben, so bindet sie an die passenden DNA Abschnitte. Auf diese Weise lässt sich direkt ablesen, ob die zu testende DNA die Mutation enthält, oder nicht.
Wirft ein Ergebnis der „Chip“ oder PCR basierten Methoden Fragen auf, so wird es in der Regel mittels Sanger-Sequenzierung nochmals überprüft.

Autorin:

Dr. Melissa Cox
ist auf Tiergenetik spezialisiert. Sie hat den Doktortitel auf dem Gebiet der Genetik an der Texas A&M Universität erworben. Ihre Arbeit hat sich seitdem auf vergleichende Tiergenetik konzentriert. Der Schwerpunkt lag dabei stets auf Haustieren. Sie stand in der Vergangenheit verschiedensten Tierzüchtern beratend zur Seite und hat bereits mit einigen Zuchtverbänden zusammengearbeitet, um Mitarbeiter auszubilden und hat mit diesen hervorragende Strategien zur Verbesserung der Zuchtprogramme entwickelt. Sie wurde im September 2016 als Wirtschaftsvertreterin für die Pferdekommission der EAAP (European Federation of Animal Science) in Belfast gewählt.