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Die letzte Grenze


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Spektrum der Wissenschaft - epaper ⋅ Ausgabe 2/2023 vom 14.01.2023

FLUORESZENZMIKROSKOPIE

Artikelbild für den Artikel "Die letzte Grenze" aus der Ausgabe 2/2023 von Spektrum der Wissenschaft. Dieses epaper sofort kaufen oder online lesen mit der Zeitschriften-Flatrate United Kiosk NEWS.

Bildquelle: Spektrum der Wissenschaft, Ausgabe 2/2023

Verena Tang ist Chemikerin und Redakteurin bei »Spektrum der Wissenschaft«.

AUF EINEN BLICK

Zoom aufs Molekül

1 Um lebende Materie zu beobachten, nutzt man Fluoreszenzmikroskopie. Seit Forscher das Feld in den 2000er Jahren revolutionierten, kann man damit Strukturen bis etwa 20 Nanometer auflösen.

2 Mi teiner neuen Technik lassen sich jetzt aber sogar Details bis auf einzelne Nanometer und darunter unterscheiden.

3 So beobachten Fachleute bereits einzelne Proteinbewegungen und lokalisieren Moleküle in winzigen Zellstrukturen innerhalb von Millisekunden nanometergenau.

»Danger – Laser on!«, warnt ein leuchtendes Schild. Daneben steigt Jessica Matthias in eine schwarze Tonne, die an eine Litfaßsäule erinnert. Die Säule dreht sich, und als die Öffnung wieder sichtbar wird, ist die Forscherin verschwunden. Ein beherzter Schritt hinein, eine halbe Umdrehung, und man tritt auf der anderen Seite in einen schummrig rot beleuchteten Raum. Alle Fenster sind mit ...

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... schwarzer Folie abgeklebt. Ein langer optischer Tisch steht auf schwingungsgedämpften Füßen, darauf eine weiträumige, mit dunklen Planen abgedeckte Apparatur. Neben dem Tisch thront ein großes Mikroskop, rechts davon steht ein Schreibtisch mit mehreren Bildschirmen. Hier, im Untergeschoss des Max-Planck-Instituts für medizinische Forschung in Heidelberg, vermisst das Team um den Physiker Stefan Hell gerade nanometergenau die Bewegungen einzelner Moleküle – in Echtzeit.

Jessica Matthias, Postdoc der biophysikalischen Chemie in Hells Forschungsgruppe, zeigt auf das Gerät unter der schwarzen Plane. »Mit diesem Aufbau haben wir das Kinesin gemessen«, sagt sie leise. Wir dürfen nicht zu laut sein, da sogar Sprechen die laufende Messung stören kann. Deswegen ist die Apparatur auch nach hier unten verbannt, denn dort sind die Erschütterungen, die von außen ankommen, am geringsten. Kinesin-1 ist ein winziger zellulärer Transporter. Er bringt Bausteine für Proteine und weitere Fracht innerhalb einer Zelle von einem Ort zum anderen, indem er an kleinen Röhren entlangläuft, den so genannten Mikrotubuli. Im Prinzip kann man sich das Motorprotein wie zwei ineinander verdrillte Schnüre vorstellen, an deren Ende sich zwei klobige Fortsätze befinden. Die beiden Ausstülpungen setzt das Protein abwechselnd voreinander und »läuft« so auf den Mikrotubuli. Tatsächlich erinnern sie damit an Füße, werden in der Biologie aber als Köpfe bezeichnet.

Die Doktoranden Lukas Scheiderer und Jan Otto Wolff aus Hells Team haben jeden dieser Schritte minutiös beobachtet: mit einer Genauigkeit von 1,7 Nanometern (ein Nanometer ist ein Milliardstel Meter) und mit einer zeitlichen Auflösung von weniger als einer Millisekunde. Um das zu ermöglichen, hat Nobelpreisträger Hell vor Kurzem zwei Ideen kombiniert, die jede für sich bereits eine Revolution der Mikroskopie darstellten.

Die Welt der Moleküle ist dem menschlichen Auge verborgen. Die Teilchen sind nicht nur zu klein, sie bewegen sich auch zu schnell, als dass wir sie live nachverfolgen könnten. Um in den Nanokosmos vorzudringen, bedienen sich Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler einer Reihe ausgeklügelter Techniken: Die Elektronenmikroskopie erreicht durch Messung der Elektronendichte eine Präzision von Zehntelnanometern, kann mitunter einzelne Atome voneinander unterscheiden. Viele hundert Aufnahmen werden dazu angefertigt, übereinandergelegt und ergeben schließlich das detaillierte Bild. Die Bewegungen von Proteinen wiederum lassen sich mit aufwändigen Computersimulationen nachvollziehen. Lebendes Material direkt zu beobachten, gelingt aber nur mit einem Lichtmikroskop.

Seit Jahrzehnten nutzen Biologen dazu Fluoreszenzmikroskope: Diejenigen Strukturen, die man sichtbar machen will, bringt man gezielt zum Leuchten – entweder durch fluoreszierende Proteine oder durch kleine Moleküle, die an die interessierende Struktur gekoppelt und dann per Laserstrahl zum Leuchten angeregt werden (siehe »Fluoreszenz«). Mit dieser Fluoreszenzmarkierung kann man nahezu jede Struktur in lebendem Material in leuchtendem Rot, Grün, Blau oder anderen Farben sichtbar machen. Die bunten Aufnahmen von Zellkernen und Co sind heute unverzichtbare Werkzeuge, um Zellvorgänge und Krankheiten zu erforschen.

Bis hierher und nicht weiter

In den 1990er Jahren war die Lichtmikroskopie allerdings kein Feld, auf dem man wissenschaftliche Lorbeeren hätte erwarten können. Die Grenzen der Technik schienen ausgereizt: Wenn ein Lichtstrahl auf eine Probe zuläuft, wird er gebeugt, und durch diese Beugung verschwimmen zwei Objekte, die näher beieinanderliegen als die halbe Wellenlänge des Lichts, zu einem einzigen Punkt.

Weil die Wellenlänge sichtbaren Lichts zwischen etwa 400 (violett) und 700 Nanometer (rot) liegt, müssen zwei Strukturen mindestens 200 bis 300 Nanometer auseinanderliegen, damit man sie noch als getrennt wahrnehmen kann. Mit dieser fixen Grenze konnte man zwar einzelne Organellen einer Zelle mit Leuchtmarkern getrennt voneinander sichtbar machen – nicht aber in deren Innenleben blicken. Verfahren, die auf anderen physikalischen Prinzipien beruhten wie die Elektronenmikroskopie, galten als vielversprechender, um kleinste Strukturen aufzulösen. Ihr Manko: Sie eignen sich nicht, um lebendes Material oder Bewegung direkt zu beobachten. Die biologischen Abläufe im Nanokosmos, so schien es, sollten dem menschlichen Blick für immer verborgen bleiben.

Hell versuchte dennoch, die Auflösungsgrenze zu knacken. Seine entscheidende Idee stellte er 1994 in der Fachzeitschrift »Optics Letters« vor: Während ein punktförmiger Laserstrahl die Fluoreszenzmoleküle zum Leuchten anregt, schaltet ein zweiter Laserstrahl einen Großteil von ihnen direkt wieder aus – mittels stimulierter Emission. Dieser ausschaltende STED-Strahl (STED steht für Stimulated Emission Depletion, deutsch stimulierter Entzug der Molekülanregung, siehe »Fluoreszenz«) besitzt die Form eines Donuts: Er hat in der Mitte ein Loch. Alle Moleküle im Bereich des »Donut«-Rings werden ausgeschaltet, so dass allein die wenigen in der Mitte noch Leuchtsignale aussenden können. Die Auflösung steigt dadurch um ein Vielfaches, weil der Ausschaltstrahl den Bereich, in dem Moleküle leuchten können, massiv verkleinert. Mit der Kombination aus An- und Ausschaltstrahl rastert man die gesamte Probe ab und erhält so ein mehrfach schärferes Bild als mit einem gewöhnlichen Fluoreszenzmikroskop.

Um das Jahr 2000 erweiterte Hell das STED-Konzept durch andere Mechanismen des molekularen An- und Ausschaltens der Fluoreszenz, wie sie ab 2006 auch der Physiker Erich Betzig, heute an der University of California in Berkeley, und weitere Forscher in den USA erfolgreich verwendeten. Doch Betzig schaltete benachbarte Fluoreszenzmoleküle nicht durch einen genau positionierten Donut-Strahl an und aus, sondern jedes einzelne Molekül für sich – an einem zufälligen Ort. Er nutzte dabei W. E. Moerners Entdeckung, dass man einzelne organi- sche Moleküle optisch detektieren kann. Bei diesem Einzelmolekülverfahren stellt man sicher, dass innerhalb des 200 bis 300 Nanometer großen Bereichs, in dem zwei Leuchtsignale auf Grund der Lichtbeugung nicht sauber voneinander zu trennen wären, statistisch gesehen maximal ein Molekül angeschaltet und damit leuchtfähig ist, während alle anderen nicht fluoreszieren können. So lässt sich dieses Molekül problemlos von seinen Nachbarn unterscheiden. Um herauszufinden, wo genau sich nun das angeschaltete Molekül innerhalb des 200 bis 300 Nanometer großen Bereichs befindet, registriert man den Beugungsfleck des Fluoreszenzlichts auf einer Kamera und berechnet sein Maximum. Denn das Maximum des Beugungsflecks muss der Molekülposition in der Probe entsprechen. Betzig taufte seine Methode »Photo-Activation Localization Microscopy«, kurz PALM. Die Physikerin Xiaowei Zhuang, die das Verfahren an der Harvard University fast zeitgleich entwickelte, nannte es STORM, kurz für »Stochastic Optical Reconstruction Microscopy«. Bei beiden Vorgehensweisen erhält man durch mehrere Messungen statistisch ein Bild aller in der Probe an verschiedenen Zeiten und Orten angeschalteten Fluoreszenzmoleküle, so dass das scharfe Bild sich durch die Registrierung vieler einzelner Fluoreszenzmoleküle aufbaut.

Fluoreszenz

Manche Stoffe leuchten, wenn man sie mit Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt. Das Phänomen kennt man etwa von Markern oder von chininhaltigen Getränken, die unter UV-Licht bläulich strahlen. Fluoreszierende Objekte beginnen nach der Anregung zu leuchten; erfolgt das Leuchten zeitverzögert, wie etwa bei manchen Aufklebern für die Zimmerwand, spricht man von Phosphoreszenz.

Das Licht, das auf die Substanz trifft – der Anregungsstrahl –, hebt ein Elektron aus dem Grundzustand in einen anregten Zustand. Von hier aus springt es durch Abgabe von Strahlung wieder in den Grundzustand. Einen Teil der Energie des auftreffenden Lichts gibt das Elektron durch strahlungslose Übergänge ab; daher ist das ausgesandte Licht energieärmer und besitzt eine höhere Wellenlänge, ist also gegenüber dem Anregungslicht rotverschoben (Stokes-Verschiebung). Aus diesem Grund können etwa mit UV-Licht angeregte Substanzen Licht im sichtbaren Bereich abgeben.

Stimulierte Emission

Der Übergang vom angeregten Zustand in den Grundzustand lässt sich durch Stimulation mit Licht der entsprechenden Wellenlänge erzwingen (stimulierte Emission). Das Molekül kann dadurch nicht mehr fluoreszieren.

Im Gegensatz zu diesen stochastischen Verfahren steuert man bei STED genau, in welcher Region die Moleküle fluoreszieren und wo sie dunkel bleiben, und tastet die Probe mit der Kombination aus Anregungs- und STED-Laser räumlich kontrolliert ab.

Fenster zu einer neuen Welt

Alle drei Methoden brachten es auf Auflösungen um die 20 Nanometer, zehnmal feiner als mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop möglich (siehe »Jenseits der Beugungsgrenze«). Damit öffneten sie das Fenster zu einer neuen Welt, die man bis dahin nur als verwaschene Schemen wie durch Ornamentglas betrachten konnte. Konnte man beim Blick auf eine Zelle bislang nur grob erahnen, wo sich welche Organellen befinden, so sah man jetzt deren Proteinverteilung im Detail. Auf dem Gang von Hells Forschungstrakt säumen überdimensionale Fotografien, gut ein mal ein Meter groß, die wichtigsten Meilensteine: hunderte grüne Punkte leuchten vor schwarzem Grund, jeden von ihnen umgibt ein Ring kleinerer, rot leuchtender Pünktchen: Kernporenkomplexe, in natura mit einem Durchmesser von zirka 100 Nanometern. Das Zytoskelett einer Säugetierzelle, ein orange fluoreszierendes Netzwerk filigraner Linien, die sich durch eine schwarze Landschaft schlängeln wie das leuchtende Wirrwarr aus Straßen, das man bei Nacht aus einem Flugzeug sehen kann. Oder der Wachstumskegel einer Nervenzelle, die winzigen Strukturen hervorgehoben in Pink, Grün und Violett. 2014 erhielten Hell, Betzig und Moerner für ihre Errungenschaften den Nobelpreis für Chemie.

Doch der Blick auf die feinen Zellstrukturen war dem Heidelberger Physiker nicht genug. Ende August 2022 sitzt Stefan Hell in einem Gartenstuhl auf dem Rasen des Max-Planck-Instituts am Neckar und erzählt, wie er auf die Idee kam, die ultrahochauflösenden Verfahren zu »verheiraten«. Der Wissenschaftler spricht schnell, so als könne er die vielen Worte gar nicht rasch genug loswerden, bevor sie veralten.

2007 lud ihn ein Redakteur der Fachzeitschrift »Science« ein, einen Übersichtsartikel über ultrahochauflösende Fluoreszenzmikroskopie zu verfassen. Dabei erkannte Hell, dass STED und PALM/STORM die Moleküle grundsätzlich auf die gleiche Art und Weise voneinander trennen, nämlich über das An- und Ausschalten ihrer Fluoreszenz. Letztlich ist bei beiden Verfahren der springende Punkt, Moleküle innerhalb des Radius von 200 bis 300 Nanometer – der Beugungsgrenze – über An und Aus zu unterscheiden; sonst bleiben sie beugungsbegrenzt. »PALM/STORM und STED sind damit grundsätzlich miteinander verwandt«, betont Hell, »es ist erstaunlich, dass die Leute das nicht gleich verinnerlichten.« Nicht die genaue Bestimmung der Mitte des Fluoreszenz-Beugungsflecks von einzelnen Molekülen auf der Kamera sei für PALM/STORM entscheidend gewesen: »Der Grund, weshalb man plötzlich scharfe Bilder bekam, war, dass man sie über das Schalten ihrer Fluoreszenzfähigkeit trennen konnte.«

Aber dort, wo sich die Verfahren unterscheiden, erkannte Hell, ergänzen sie sich ideal. Die Stärke der PALM/ STORM-Verfahren ist es nämlich, die Moleküle einzeln voneinander zu trennen – also mit der maximal möglichen Feinheit, denn es ist unmöglich, eine Probe feiner zu »sezieren« als auf der molekularen Ebene. Wo das Molekül allerdings zu einem bestimmten Zeitpunkt aufleuchtet – und damit welches genau –, bleibt dem Zufall überlassen, die exakte Position muss man anschließend herausfinden. Umgekehrt weiß man bei STED immer, woher das Signal kommt, weil der präzise gesteuerte Donut das vorgibt. Aber STED kann die Moleküle nicht einzeln ansteuern.

Hell schrieb seine Idee auf, veröffentlichte sie – doch bei den meisten Kollegen verfing sie nicht wirklich. Für viele war der Gedanke, dass alle Methoden letztendlich auf demselben Prinzip beruhen, fremd. »Ich konnte mir damals nicht vorstellen, dass sich eine solche grundlegende Erkenntnis nicht gleich durchsetzt. Das schnell wachsende Feld der Superauflösung glaubte wirklich, der Witz bei PALM/STORM sei die genaue Bestimmung der Mitte des Fluoreszenzmusters auf der Kamera«, erzählt der Forscher rückblickend und gesteht: »Das hat mich wirklich nachdenklich gemacht, wie Wissenschaft manchmal läuft.«

Doch Hell sieht das als Chance. »Wenn man etwas gut durchdrungen hat, dann hat man auch gute Chancen, den nächsten Durchbruch zu machen«, führt er seinen Gedankengang fort. »Ich bekam so die Idee, das Verfahren zu revolutionieren, mit dem man die Position einzelner Moleküle bestimmt – und zwar mit einem Donut.«

2011 meldet er ein Patent an: eine neue Technik namens MINFLUX, die Elemente von STED mit denen der Einzelmolekülmikroskopie zusammenführt. Mit dieser Methode haben Hell und sein Team die Skala, auf der Forscherinnen und Forscher lebende Materie beobachten können, noch einmal um das Zehnfache verfeinert. Statt einzelner Organellen können Fachleute jetzt die darin aktiven Proteine räumlich und zeitlich genau verfolgen.

Doch zunächst kam 2014 der Nobelpreis für die Entwicklung von STED. »Das war natürlich etwas ablenkend«, kommentiert der Physiker die Auszeichnung und wundert sich immer noch, dass niemand vor ihm die hochauflösenden Methoden miteinander kombiniert hat: »Obwohl die Quintessenz draußen war, ist nichts in diese Richtung passiert.« Im Dezember 2016 publizieren Hell und Mitarbeiter schließlich die erste Veröffentlichung zu MINFLUX. Auf einer Tagung kündigt ihn ein Wissenschaftler mit den Worten an, die Gemeinschaft der Einzelmolekülmikroskopiker sei von MINFLUX überrumpelt gewesen. »Wenn man glaubt, dass die Bestimmung der Spitze des Beugungsflecks auf einer Kamera essenziell für die Hochauflösung ist, denkt man an nichts anderes. Das war das psychologische Problem«, konstatiert Hell.

Die MINFLUX-Nanoskopie nutzt das stochastische An- und Ausschalten einzelner Moleküle der PALM/ STORM-Methode und kombiniert es mit der genauen Lokalisierung aus dem STED-Ansatz. Zunächst aktiviert man nur wenige Fluoreszenzmoleküle, die sich in einer Probe befinden: Das heißt, man bringt sie in einen Zustand, in dem sie bei Anregung durch einen entsprechenden Laserpuls leuchten können. Entscheidend ist, dass dann ein Laserstrahl mit einer Nullstelle in der Mitte – also ein donutförmiger Laser wie bei STED – die Probe Stück für Stück präzise abrastert. Doch diesmal regt der Donut die Moleküle nicht ab, sondern zur Fluoreszenz an. Darüber hinaus verwendet man statt einer Kamera einen einfachen Detektor, der das einfallende Fluoreszenzsignal registriert. Das erlaubt es auch, tiefer in die Zelle vorzudringen.

Trifft das »Loch« des Donutstrahls auf ein Fluorophor, kommt kein Fluoreszenzphoton im Detektor an: Denn in der Mitte des Donuts ist die Intensität des Anregungslasers gleich null. Trifft das Donutloch aber knapp daneben, wird der Fluorophor leicht angeregt und leuchtet schwach. Weil die Intensität des Anregungslasers von der Mitte zum Rand hin ansteigt, verändert sich die Zahl der ausgesandten Photonen mit dem Abstand von der Nullstelle. So verrät das Leuchten, wie nah die Donutmitte an der unbekannten Position des Moleküls ist. Je kleiner der Abstand, desto weniger Fluoreszenzphotonen braucht man, um herauszufinden, wo das Molekül liegt. Und diesen Abstand kann man Zug um Zug verringern, um die Genauigkeit nach oben zu treiben.

Volle Kontrolle

Die Wissenschaftler »injizieren« die Koordinaten sozusagen in die Probe: Der Doktorand Jan Otto Wolff, Erstautor der Veröffentlichung, erklärt: »Indem wir die Nullstelle sub-nanometergenau steuern, haben wir die volle Kontrolle darüber, wo sie sich befindet.« Weniger als 100 Fluoreszenzphotonen genügten ihm und seinen Kollegen bei der Messung des Kinesins, um das Molekül mit Präzisionen von unter einem Nanometer zu beobachten. Mit dem PALM-Verfahren bräuchte dazu man mehrere tausend, falls man überhaupt die Genauigkeit erreichen könnte.

In der »Mikroskopie-Facility« des Instituts steht eins der MINFLUX-Mikroskope, die die Firma Abberior Instruments, eine Ausgründung der Max-Planck-Gesellschaft, heute weltweit vertreibt. Auf einem schwingungsgedämpften optischen Tisch sieht man einen Koffer aus Aluminium mit der Aufschrift MINFLUX, schätzungsweise zwei Meter lang, einen breit und rund 20 Zentimeter hoch. Darin befindet sich der optische Aufbau für die Laser; neben dem Koffer steht das dazugehörige Mikroskop. An einem großen Bildschirm auf einem Schreibtisch sind drei Bilder zu sehen (»Detailaufnahme«): Rechts orangefarbene längliche Strukturen auf schwarzem Hintergrund, eine mit einem gewöhnlichen Lichtmikroskop erstellte Aufnahme einer Nervenzelle. Man erkennt verwaschen die Dornfortsätze auf dem Dendriten. In der Mitte ein großes quadratisches Bild mit unregelmäßig angeordneten, größeren und kleineren orangeroten Punkten. Während diese beiden Darstellungen starr sind, tut sich in der linken etwas. Ein paar blau-violette Pünktchen sind sichtbar, langsam leuchten immer mehr davon auf. Das ist die laufende MINFLUX-Aufnahme. Jeder Punkt steht für ein detektiertes Signal, die Farbe zeigt die Zahl der emittierten Photonen an. Der Doktorand, der uns erlaubt hat, seiner Messung beizuwohnen, hat sich aus der rechten, konfokalen Aufnahme einen etwa 6 x15 Mikrometer kleinen Ausschnitt ausgesucht, den er sich jetzt detaillierter ansehen will. Zirka drei Stunden wird die Messung dauern. Hinterher wird man auf den Nanometer genau sehen, wo die Fluoreszenzmarker leuchten, mit denen er die Probe versehen hat.

Für diese Art der Mikroskopie benötigen die Forscher schaltbare Fluoreszenzfarbstoffe. Zunächst sind die Moleküle ausgeschaltet: Sie befinden sich in einer Art Dornröschenschlaf, in dem sie sich nicht anregen lassen. Erst Aktivierung mit Licht ändert ihre chemische Struktur, woraufhin sie ein Laser passender Wellenlänge zum Leuchten bringen kann. Für präzisere Aufnahmen ersinnt ein Team von Chemikerinnen und Chemikern in Hells Heidelberger Labor ausgeklügelte Schaltmechanismen. Die meisten solcher Techniken konzentrierten sich bislang darauf, bei der Aktivierung bestimmte chemische Gruppen abzuspalten oder Ringe aus Atomen zu öffnen. In einem neuen Ansatz ging ein Team aus Hells Abteilung 2021 den umgekehrten Weg und schuf eine Gruppe von Molekülen, die durch Lichtaktivierung einen zusätzlichen Ring im Molekül schlossen. Diese Farbstoffe bleichen nicht so schnell aus und sind langlebiger, was für die Messung von Vorteil ist.

Nur Millisekunden dauert es, wenn das Kinesin-Molekül einen Fuß vor den anderen setzt. Den Mechanismus genau zu untersuchen, ist daher schwierig. Zwar ist der molekulare Transporter laut Jessica Matthias das wohl am besten untersuchte Motorprotein in der Zelle, trotzdem sind manche Details des Bewegungsablaufs noch nicht geklärt.

Bislang ließ es sich mit zwei Methoden beobachten: Bei der einen heftete man Nanokügelchen an die Kinesin-Moleküle und hielt sie mit Hilfe fokussierter Laserstrahlen – einer so genannten optischen Pinzette – fest. Indem man die Kraft maß, die auf die Kügelchen wirkte, konnte man auf die Bewegung des Proteins schließen. So hat man in den letzten Jahren herausgefunden, dass Kinesin sich stückweise um jeweils acht Nanometer vorwärtsbewegt und dazwischen kurz innehält. 2021 beobachtete eine Gruppe um Erik Schäffer, Professor für zelluläre Nanowissenschaften an der Universität Tübin- gen, dass diese Schritte in Zwischenschritte von vier Nanometern aufgeteilt sind.

Doch solche Messungen zeigen stets nur, wie sich der Schwerpunkt des Moleküls bewegt. Wie sich die Füße genau verhalten, ist unklar – denn die Kügelchen, die man verfolgt, sind mit rund 80 Nanometern Durchmesser im- mer noch riesengroß gegenüber den etwa 2 Nanometer winzigen Kinesinfortsätzen. Bei der anderen Methode befestigt man daher kleine Fluorophore an speziellen Stellen des Proteins. Eine solche Aufnahme dauerte aber mehrere hundert Millisekunden, und so ließen sich die sehr raschen Bewegungen bislang nicht richtig beobachten.

Lukas Scheiderer und Otto Wolff haben die winzigen Bewegungen in ihrer Doktorarbeit jetzt erstmals in Echtzeit sichtbar gemacht – das heißt unter der üblichen ATP-Konzentration einer lebenden Zelle und damit bei der Geschwindigkeit, mit der das Transportmolekül dort voranschreitet. Dazu brachten sie kleine Fluoreszenzmar- ker an den Füßen an und verfolgten deren Position mit einem MINFLUX-Mikroskop.

Jenseits der Beugungsgrenze

Um Strukturen in lebenden Organismen sichtbar zu machen, arbeitet die Biologie mit Fluoreszenzmarkern: Farbstoffen, die sich an spezifische Strukturen in einer Zelle binden und nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge leuchten.

Eine natürliche Grenze beschränkt die Auflösung solcher Bilder: Durch die Beugung des Lichts lassen sich zwei Objekte, die dichter als etwa die halbe Wellenlänge des emittierten Lichts beieinanderliegen, nicht mehr getrennt voneinander wahrnehmen. Weil sichtbares Licht zwischen 400 und 700 Nanometer Wellenlänge besitzt, liegt die Grenze bei rund 200 bis 300 Nanometern. Seit den 1990er Jahren haben Wissenschaftler Verfahren ersonnen, um diese natürliche Auflösungsgrenze auszutricksen. Alle haben eins gemeinsam: Sie sorgen über das An- und Ausschalten der Fluoreszenz dafür, dass nur wenige Moleküle gleichzeitig leuchten.

STED

Die von Stefan Hell entwickelte Technik beruht auf Verhinderung der Fluoreszenz durch stimulierte Emission (englisch: Stimulated Emission Depletion).

Wie in der klassischen Mikroskopie regt ein Laserstrahl Fluoreszenzmoleküle in einem bestimmten Bereich zum Leuchten an. Ein weiterer, »donutförmiger« Laserstrahl nimmt durch stimulierte Emission allen Molekülen die Fluoreszenzfähigkeit weg – außer denen, die sich in einem sehr kleinen Bereich in der Mitte des »Donuts« befinden. Je kleiner dieser Bereich um die Nullstelle des STED-Lasers ist, desto weniger Moleküle können gleichzeitig leuchten und desto schärfer ist das Bild. Mit solch einer Kombination aus An- und Ausschaltstrahl wird die Probe systematisch abgetastet.

PALM/STORM

Hier sind die Fluoreszenzmoleküle anfangs aus, also in einem Zustand, in dem sie bei Bestrahlung mit Anregungslicht nicht fluoreszieren können. Beim Einschalten wird die Probe zuerst mit Anschaltlicht so schwach beleuchtet, dass statistisch höchstens ein Molekül innerhalb der Beugungsgrenze von 200 bis 300 Nanometer angeschaltet wird, räumlich völlig zufällig. Die zunächst unbekannte Position der angeschalteten Moleküle bestimmt man anschließend anhand des Beugungsmusters, das durch die Fluoreszenz einzelner Moleküle auf einer Kamera entsteht. Dabei wird das Maximum (oder der »Schwerpunkt«) des Beugungsmusters gleichgesetzt mit der auf die Fokalebene herunterprojizierte Position des Moleküls. Das nennt man »Lokalisieren«. Danach werden die so registrierten und lokalisierten Moleküle ausgeschaltet und eine Runde neuer Moleküle eingeschaltet.

Bei diesem PALM (»Photo-Activation Localization Microscopy«, etwa »Mikroskopie durch Photoaktivierung und Lokalisierung«) oder STORM (»Stochastic optical reconstruction microscopy«, etwa »stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie«) genannten Verfahren verwendet man also Fluoreszenzmoleküle, die sich aktiv schalten lassen oder sich spontan an- und ausschalten (»blinken«). Während das sequenzielle An- und Ausschalten einzelner Moleküle ihre Trennung erlaubt, verrät das Auffinden der Mitte ihres Beugungsmusters ihre Position. Wendet man das auf (fast) alle Moleküle in der Probe an, erhält man ein scharf aufgelöstes Bild. Die Auflösung ist vergleichbar mit der von STED-Bildern.

MINFLUX

MINFLUX vereint Elemente aus dem STED-Verfahren und den stochastischen Ansätzen. Wie in PALM/ STORM verwendet man Moleküle, die sich wiederholt an- und ausschalten lassen. Zunächst wird statistisch maximal ein Fluoreszenzmolekül pro Beugungsbereich aktiviert – das heißt, in einen Zustand gebracht, in dem es bei entsprechender Beleuchtung mit Anregungslicht fluoreszieren kann. Entscheidend ist, dass dann ein Anregungsstrahl mit einer Nullstelle in der Mitte – also ein donutförmiger Laser wie bei STED, doch diesmal zum Anregen – die Probe Stück für Stück abtastet. Die Position des Donuts und damit der Donut-Nullstelle steuert man auf weniger als einen Nanometer genau, weshalb sie immer exakt bekannt ist.

Befindet sich ein Fluorophor direkt in der Mitte des Anregungsstrahls, bleibt das Molekül dunkel, denn dort ist die Intensität des Anregungsstrahls null. In diesem Fall hat man die Position des Fluoreszenzmoleküls genauestens herausgefunden, weil sie mit der exakt bekannten Position der Donut-Nullstelle identisch sein muss. Liegt die Nullstelle aber knapp neben dem Molekül, so glimmt es schwach. Weil die Intensität des Anregungslasers zum Donutring hin ansteigt, verrät die Zahl der emittierten Photonen den Abstand des Moleküls zur Nullstelle und somit die Position des Moleküls: Je schwächer es leuchtet, desto enger sind die beiden zusammen. Im MINFLUX-Verfahren tastet der donutförmige Anregungsstrahl die Probe Stück für Stück ab und optimiert dabei auf minimale Fluoreszenz per eingestrahlter Laserleistung. Je besser man es schafft, die Nullstelle mit dem Molekül räumlich zu überlappen, umso genauer lässt sich dessen Ort bestimmen. Die Wissenschaftler erhalten auf diese Weise hochpräzise Molekülpositionen. In Verbindung mit dem sequenziellem An- und Ausschalten aller Fluorophore erreichen die Bilder Auflösungen von 1 bis 3 Nanometer, also auf Molekülgröße.

MINSTED

MINSTED kombiniert ebenfalls die Stärken der Einzelmolekülmikroskopie mit der genauen Lokalisation des STED-Verfahrens. Anders als bei MINFLUX kommen jedoch ein Anschalt- sowie ein Ausschaltlaser (STED) zum Einsatz.

Auch hier verwendet man schaltbare Fluoreszenzmoleküle. Zunächst wird durch stochastisches Anschalten ein Molekül pro Auflösungsgrenze aktiviert. Das Abtasten der Probe funktioniert gleich wie bei Minflux, aber mit einem Laseraufbau wie bei STED: einem Anregungsstrahl und einem donutförmigen Ausschaltstrahl. Die Intensität eines Fluoreszenzmoleküls ist demnach dann am größten, wenn das Zentrum des Donuts sich direkt über ihm befindet. Da man die Beziehung zwischen Abstand von der Nullstelle und Intensität kennt, erfolgt die Lokalisation hier ebenfalls durch diese Beziehung. Mit MINSTED kann man die leuchtenden Moleküle heute bis auf wenige Ångström, also Zehntelnanometer, lokalisieren.

Das Ergebnis lässt sich am Computer sehen: Jessica drückt auf »Play« und von links nach rechts füllt sich das Bild mit Punkten in Hell- und Dunkelblau, Türkis, Grün und Gelb. Es sind die »Fußspuren« verschiedener Kinesin-Moleküle, Schritt für Schritt. Jede Farbe zeichnet eine imaginäre horizontale Linie nach; die Transportproteine laufen brav die einzelnen Mikrotubuli entlang, wie Loks auf verschiedenen Gleisen. Bis auf eines, das zwischendurch die Fahrspur wechselt (siehe »Fußspuren«).

Für die Messung hat das Team einen speziellen Aufbau ersonnen: Statt des »Donuts« haben sie zwei »Brötchen« verwendet. Das klingt wie ein Witz, aber die Begriffe werden in der Topologie vollkommen ernsthaft benutzt. Beim »Brötchen« ist die Nullstelle anders als beim »Donut«: Statt eines Lochs in der Mitte des kreisförmigen Laserstrahls teilt eine waagrechte Linie ihn in eine obere und eine untere Hälfte. Dank der neuen Geometrie steigt die Intensität des Lasers von der Nullstelle zum Maximum hin schneller an. Damit wird die Nullstelle präziser.

Zwei Brötchen statt eines Donuts

Um dem Kinesin bei seinem Gang über die Mikrotubuli zuzusehen, haben die Heidelberger Physiker zwei solcher Brötchen-Laser orthogonal zueinander ausgerichtet und in Millisekundenschnelle zwischen ihnen hin- und hergeschaltet. Dadurch schrumpfte die nicht beleuchtete Stelle auf ein kleines Quadrat dort, wo sich die Nullstellen der beiden Laser überlappen. Im Einklang mit bisherigen Erkenntnissen sahen sie, dass zwei aufeinanderfolgende Schritte das Molekül um insgesamt 16 Nanometer vorwärtsbrachten. Jeder Schritt sollte dabei laut früheren Studien 8 Nanometer betragen. In ihren Messungen sahen Scheiderer und Kollegen jedoch ein anderes Muster: Schritte von 6 und 10 Nanometer Länge wechselten sich ab. Das führten sie darauf zurück, dass ihr Fluoreszenzmarker an einem der umeinandergewickelten Stränge angebracht war und damit nicht genau in der Mitte des Proteins saß: Befand sich gerade der Fuß vorn, an dessen Strang der Fluorophor saß, war der Fluoreszenzmarker von der Molekülmitte aus um 2 Nanometer nach vorn versetzt; beim nächsten Schritt befand er sich hingegen 2 Nanometer hinter der Molekülmitte. Das bestätigten die Fachleute, indem sie zwei identische Fluoreszenzmarker an beiden Proteinsträngen anhefteten: Nun sahen sie das erwartete Muster von 8 Nanometern Länge.

»Ein Fluoreszenzmikroskop sieht Fluoreszenzmoleküle. Nichts anderes«, sagt Hell plakativ (siehe Interview bei »Spektrum Plus«, online). Die Auflösung der Mikroskope ist jetzt an einem Punkt, an dem die Größe der Fluoreszenzmarker und ihr Abstand zu den Strukturen, die man eigentlich sichtbar machen möchte, zum Tragen kommt. Oder, anders gesagt: Die leuchtenden Moleküle selbst sind plötzlich der limitierende Faktor.

Das hat Hell mit seiner anderen Forschungsgruppe im November 2022 eindrucksvoll gezeigt. Der Wissenschaftler forscht an zwei Standorten: Außer seinem Team in Heidelberg leitet er gleichzeitig eines am Göttinger Max-Planck-Institut für Multidisziplinäre Naturwissenschaften. Dort wurden jetzt Fluoreszenzmoleküle bis auf gut zwei Ångström genau verortet. Ein Ångström ist ein Zehntelnanometer – so groß sind einzelne Atome.

FUSSSPUREN Das Motorprotein Kinesin bewegt sich mit winzigen, immer gleichen Schritten entlang zellulärer Strukturen. Die Heidelberger Wissenschaftler haben es Schritt für Schritt dabei beobachtet. Jede Farbe steht für ein anderes Kinesin-Molekül.

Das gelang ihnen mit einer Technik namens MINSTED, welche sie 2021 in der Zeitschrift »Nature Photonics« vorstellten. Wie bei MINFLUX verwendet man dazu schaltbare Fluoreszenzmoleküle und aktiviert zufällig einzelne von ihnen; anschließend verortet man sie nicht nur mit einem Laser, der die Moleküle anschaltet, sondern wie bei STED mit einer Kombination aus An- und Ausschaltstrahl (siehe »Jenseits der Beugungsgrenze«). Bislang erreichte man so Auflösungen von 1 bis 3 Nanometer.

Bei der STED-Mikroskopie wählt man die Photonen des ausschaltenden Strahls möglichst energiearm, das heißt im roten oder nahinfraroten Wellenlängenbereich. Daher liegen gängige STED-Laser bei einer Wellenlänge von 775 Nanometern. So will man sicherstellen, dass die Photonen des »Ausschaltstrahls« nur ausschalten – und nicht versehentlich andere Moleküle zum Leuchten anregen und so das Signal verfälschen. Die rotverschobene Wellenlänge hat aber auch zur Folge, dass das Ausschalten durch STED weniger effizient ist und man einen intensiverenn Strahl braucht.

Dank der schaltbaren Fluoreszenzmarker ist es bei MINSTED jedoch nicht mehr notwendig, den STED-Laser auf den roten Bereich zu limitieren. Denn innerhalb des beleuchteten Flecks ist statistisch nur ein einzelner Fluorophor aktiv, alle anderen befinden sich in ihrem Dornröschenschlaf und reagieren nicht, wenn der STED-Strahl sie trifft. So kann der Laser keinen zufällig zum Leuchten bringen. Also verschob Hell die Wellenlänge des STED-Strahls zu kürzeren (»blauverschobenen«) Wellenlängen.

Damit ließ sich plötzlich das volle Potenzial der Fluoreszenz ausschöpfen: Das Hintergrundleuchten entfiel durch die schaltbaren Farbstoffe, und indem die Forscher den Laser bei kürzeren Wellenlängen betrieben, benötigten sie deutlich schwächere STED-Strahlen. Das Resultat sind Aufnahmen mit wenigen Ångström Präzision.

Hell sprüht vor Begeisterung, als er von diesem Durchbruch erzählt. »Ångström-Präzision bei Raumtemperatur! Dass das funktioniert, hätte man nicht gedacht«, jubelt der Forscher. Sein Team hat sich mit dem neuen Verfahren Kernporenkomplexe angesehen – jene Proteinkomplexe, die bereits als großformatige Aufnahme mit 20 Nanometer Auflösung bei Hell in Heidelberg im Gang prangen.

Die Vielfalt der Natur, nanometergenau

»Wir haben die Proteine mit Nanobodies markiert, an denen wiederum unsere Fluorophore gebunden waren,« erklärt Michael Weber aus Hells Göttinger Forschungsgruppe. »Davon haben wir ein hochaufgelöstes Bild erhalten. Und da wir die Größe der Nanobodies kennen, können wir über die Bilder zurückrechnen, wo das Protein liegen kann.« Auf 2,3 Ångström genau vermessen er und sein Teamkollege Henrik von der Emde auf diese Weise die Position der Fluorophore. Ihre Ergebnisse haben sie mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen des Kernporenkomplexes verglichen, die Kollegen im Juli 2022 in der Fachzeitschrift »Science« veröffentlicht haben. »Das passt hervorragend«, freut sich der Forscher.

Doch die Bilder der fluoreszierenden Marker offenbaren noch mehr. In der durchschnittlichen Kernpore sind acht spezielle Proteine regelmäßig im Kreis angeordnet. Eine Überlagerung von 81 Fluoreszenzaufnahmen zeigt diese Regelmäßigkeit wie aus dem Biologielehrbuch (siehe »Passt perfekt«). Auf den einzelnen Aufnahmen sieht man dagegen die ganze Vielfalt der Natur: Jede Pore ist individuell, manche sind leicht oval, keine gleicht der anderen exakt (siehe »Individuen«). Möglicherweise werden Fachleute in naher Zukunft mit Lichtmikroskopen feine Strukturen aufklären – nur, dass sie statt gemittelter Werte individuelle Strukturen sehen können.

Die Stärke der Lichtmikroskopie lag schon immer in der Fähigkeit, Lebendes zu beobachten. Neben dem ultrascharfen Blick auf individuelle Proteine, den MINSTED jetzt ermöglicht, liegt eine große Chance sicher in der schnellen Beobachtung kleinster Bewegungen, wie sie die Forschungsgruppe im Heidelberger Institut erstmals durchgeführt hat. Die Experimente am Kinesin liefen zwar nicht in einer lebenden Zelle, sondern im Reagenzglas, aber unter physiologischen ATP-Konzentrationen. Das Protein bewegte sich demnach realistisch schnell. Durch Messungen der ATP-Konzentration während der Aufnahmen hat das Team außerdem herausgefunden, warum das Molekül in der Mitte eines Schritts pausiert, dieser sich also in zwei Zwischenschritte von je 4 Nanometern unterteilen lässt: Hier wird das Protein mit dem Treibstoff beladen. Anschließend schwingt der Fuß nach vorn, ATP wird gespalten, und der Fuß setzt ab.

In solchem Detail war der Mechanismus noch nicht bekannt. Und jetzt bleibt lediglich die Frage offen: Dreht sich das Molekül dabei mal nach links, mal nach rechts – oder immer gleich, wie ein Walzer tanzender Mensch? Auch das glauben die Heidelberger herausgefunden zu haben: »Der Fuß scheint immer nach rechts auszuschlagen«, sagt Lukas Scheiderer. »Das spricht dafür, dass es sich wie ein Tänzer verhält«, ergänzt Jessica Matthias.

»Es wird in den nächsten Jahren zahlreiche Studien geben, die sich andere Proteindynamiken ansehen«, prognostiziert die biophysikalische Chemikerin, und sagt ganz unbescheiden: »Wir haben eine neue Domäne eröffnet.« Das sieht auch Hell so. Seiner Ansicht nach ist die Messung des Kinesins der Anfang einer Ära, in der Forscherinnen und Forscher kleinste Bewegungen von Molekülen in Echtzeit nachverfolgen. »Das ist ein Gamechanger«, ist sich der Nobelpreisträger sicher, »weil es eine komplett neue Art ist, die Position von Biomolekülen zu bestimmen«. Er erwartet, dass die Technik in fünf bis zehn Jahren auch in der Medikamentenentwicklung angewandt wird, wo sie Wechselwirkungen zwischen Wirkstoff und Zielstruktur sichtbar machen kann. Hell ist überzeugt: »Kinesin öffnet der Community erst einmal nur die Augen«.

Im Raum nebenan schlummert ein weiteres Gerät, mit schwarzen Planen abgeschirmt vor den Augen der neugierigen Besucherin. Was es damit auf sich hat, will niemand verraten. Vielleicht werden wir schon bald darüber lesen.

QUELLEN

Hell, S. W., Wichmann, J.: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters 19, 1994

Lincoln, R. et al.: A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy. Nature Chemistry 14, 2022

Weber, M. et al.: MINSTED nanoscopy enters the Ångström localization range. Nature Biotechnology 2022, doi: 10.1038/ s41587-022-01519-4 (Open Access)

Wolff, J.O. et al.: MINFLUX dissects the unimpeded walking of kinesin-1. BioRxiv 2022, doi: 10.1101/2022.07.25.501426 (Open Access)

Stefan Hell im Interview