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SENCKENBERG-FORSCHUNGSINSTITUT: Im Epizentrum der Wolfsgenetik


Wild und Hund - epaper ⋅ Ausgabe 5/2020 vom 05.03.2020

In Gelnhausen werden alle Wolfs-DNA-Proben, die von Rissen in Deutschland genommen wurden, untersucht. Doch was wird dort genau gemacht, und welche Methoden werden angewandt? Tobias Thimm hat den führenden Wolfs-Genetiker Dr. Carsten Nowak in der Forschungseinrichtung besucht.


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Fotos: Tobias Thimm, Istockphoto.com

Die Wolfsfährte führt die steinernen Treppen hinauf, mündet dann in einem dunklen Gang nach rechts. Besucher können ihr gut folgen, da sie mit bunter Farbe auf den Boden der Außenstelle der Senckenberg Gesellschaft für Naturforschung gemalt wurde. Versteckt im Ort Gelnhausen (Main-Kinzig-Kreis) ...

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Die Wolfsfährte führt die steinernen Treppen hinauf, mündet dann in einem dunklen Gang nach rechts. Besucher können ihr gut folgen, da sie mit bunter Farbe auf den Boden der Außenstelle der Senckenberg Gesellschaft für Naturforschung gemalt wurde. Versteckt im Ort Gelnhausen (Main-Kinzig-Kreis) ist die Forschungsstelle in einem unscheinbaren Buntsandsteinbau untergebracht. Nichts, nicht der kleinste Hinweis deutete von außen darauf hin, dass hier die hochbrisanten genetischen Analysen von Wolfs-DNA stattfinden. Die bunten Ballenabdrücke auf dem Fußboden waren die erste Bestätigung, keiner Verleitfährte gefolgt zu sein. In den düsteren Gängen hetzen Wissenschaftler in legeren Holzfällerhemden und angemackten Kaffeetassen umher. Es ist unangenehm kühl, und irgendwo bellen Hunde.

In einem der wenigen offenen Büros sitzt Dr. Carsten Nowak. Den Bildschirm seines PCs füllen bunte DNA-Sequenzen. Der Forscher ist völlig in seine Studien vertieft. Hastig wirft er einen weißen Kittel über und rückt das dickrandige schwarze Brillengestell zurecht. Ohne Pressesprecher will der Fachgebietsleiter für Naturschutzgenetik nicht mit dem Interview beginnen. Er füttert die Guppys in dem kleinen Aquarium auf seinem Schreibtisch. Der 42-jährige Biologe ist begeisterter Angler und hat daher eine gewisse Leidenschaft für Flossenträger. Wenig später trifft Pressesprecher Dr. Sören Dürr ein. Der gebürtige Hesse Nowak breitet Ordner mit bunten Schaubildern und Diagrammen auf dem Tisch aus. „Keine Sorge, ein gesundes genetisches Basiswissen reicht aus, um zu verstehen, was wir hier in unserer Forschungsstelle genau machen“, lächelt Nowak. Seit 2008 ist er jetzt in der Senckenberg-Außenstelle in Gelnhausen. Der Forschungsschwerpunkt dort ist neben der Genetik die Gewässerökologie. Die Abteilung gehört zum Senckenberg-Institut in Frankfurt, wo auch das gleichnamige Naturkundemuseum beheimatet ist.

2010 waren es noch 300 bis 400 Probenanalysen pro Jahr, 2018 bereits 3 000. Das Besondere an den Untersuchungen ist, dass die meisten Analysen aus Probenmaterialien, wie Losung, Urinspuren, Haaren oder Speichelresten, von gerissenen Nutztieren bestehen. Diese Proben enthalten meist nur geringe Mengen an DNA, was die Analysen erschwert. Um akkurate Ergebnisse liefern zu können, werden besonders empfindliche Laborverfahren angewandt und alle Untersuchungen mehrfach wiederholt. Die genetischen Analysen verfolgen zwei zentrale Zwecke: Zum einen werden durch die Bestimmung von Art, Individuum und Verwandtschaftsbeziehungen wichtige Monitoringdaten gewonnen, die dabei helfen, Wolfvorkommen zu erkennen und die Anzahl an Rudeln zu bestimmen. Zum anderen zeigte sich schon bald nach der Etablierung der ersten Wölfe in Deutschland, dass eine sichere Bestimmung der Verursacher von Rissen oft schwierig ist und zur Absicherung DNA-Analysen benötigt werden.

Grafiken: AS-Studio, 77sz/istockphoto.com, Dagmar Siegel

Abbildung 1: Adenin/Thymin und Cytosin/Guanin bilden zwischen den Strängen (verbundene Nukleotide) der Doppelhelix Basenpaare. Sequenzen aus drei Basen bilden eine Aminosäure. Mehrere Sequenzen bilden ein Gen, das die Erbinformation für ein Protein enthält.

Gen: Ein Abschnitt auf der DNA, der Informationen für die Entwicklung von Eigenschaften eines Individuums enthält.

Genom: Gesamtes Erbgut, d. h. die Gesamtheit aller Gene

Die tierische Zelle enthält verschiedene Zellorganellen. Der Zellkern und die Mitochondrien enthalten DNA. Je nach Untersuchungsverfahren wird Zellkern-DNA oder mitchondriale DNA verwendet.

Mittlerweile treffen mehrmals pro Woche per Post sauber in kleine Plastikröhrchen verpackte Proben mit getrockneten Tupfern von gerissen Schafen und Losungsproben in alkoholgefüllten Plastikbechern aus dem gesamten Bundesgebiet ein. Danach dauert es durchschnittlich zehn Arbeitstage, bis Nowak und seine Mitarbeiter ein eindeutiges Ergebnis bekannt geben können. Je nach den Wünschen der Einsender variieren die Kosten der Analyse. Für eine einfache Artbestimmung einer einzelnen Probe liegen sie bei etwa 100 € (verunfallte Stücke etwa die Hälfte).

Nachdem z. B. ein Landwirt einen möglichen Wolfsriss bei einer beratenden Stelle oder dem lokalen Wolfsberater des zuständigen Bundeslandes gemeldet hat, fährt ein Rissgutacher zum Tatort. Dort nimmt er die Probe (bis zu neun Tupferproben) und liefert diese an die zuständige Fachbehörde, die wiederum das Senckenberg-Institut mit der Untersuchung beauftragt, falls eine DNA-Analyse zur Täterbestimmung notwendig ist (s. Abbildungen 2 und 3).

Nowak und Dürr wollen jetzt das Labor präsentieren. Wieder geht es durch dunkle, triste Gänge. Hinter einer Stahltür im Keller beginnt eine neue Welt. Strahlendes Neonlicht erhellt riesige Kühlschränke. Alles erscheint weiß und steril, wie in einer modernen Zahnklinik. Irgendwie erinnert die Szenerie an einen Science-Fiction-Film. Neben futuristischen Maschinen und Geräten leuchten Bildschirme und blinken digitale Anzeigen. Wissenschaftler mit Pipetten und Reagenzgläsern eilen wie in einer Großküche umher. Viele tragen Mundschutz. Nowak öffnet fast feierlich eine Kühlschranktür und hält ein beschriftetes Röhrchen in die Höhe. „Das ist eine Probe für die Genanalyse. So werden die hier gelagert.“ Dürr nickt anerkennend. Tausende weitere Röhrchen warten dampfend in der Kälte.

Je nach Auftrag werden die eingeschickten Proben unterschiedlichen molekularen Verfahren unterzogen. Möchte der Auftraggeber nur wissen, ob das Probenmaterial von einen Wolf stammt oder nicht, oder will er weitere Infos etwa zur Herkunft des Individuums erhalten?

Fünf molekulare Verfahren stehen dafür zur Verfügung. Die wichtigsten Methoden, die praktisch bei allen Proben laufen, sind die Mikrosatelliten-Analyse sowie die mitochondriale Haplotypbestimmung. Die drei weiteren Methoden (SNP-Chips, Amylase-Assay und Y-Chromosomen-Untersuchungen) laufen im Rahmen der Begleitforschung in unregelmäßigen Abständen und werden nicht wie die beiden erstgenannten von Behörden beauftragt.

Für genetische Untersuchuchung ist ein Verständnis des Aufbaus der Desoxyribonukleinsäure (DNA) unumgänglich. Die DNA ist das genetische Material einer jeden Zelle eines Lebewesens und ist als Doppelhelix angeordnet. Die beiden Stränge einer Helix werden durch Basenpaare (Adenin A und Thymin T, Cytosin C und Guanin G) zusammengehalten. Die Abfolge der Basenpaare wird als Basensequenz bezeichnet. Eine Sequenz aus drei Basenpaaren bildet eine Aminosäure (AS), mehrere AS ein Protein bei der Vererbung. Die DNA wird in den Chromosen innerhalb des Zellkerns, aber auch in den Mitochondrien (Zellorganellen) gespeichert. Je nach Analyseverfahren wird Kern-DNA oder mitochondriale DNA verwendet (s. Abbildung 1).

1. Mikrosatelliten (STR) (Kern-DNA)

Die Mikrosatelliten-Analyse ist die wichtigste Methode im Wolfsmonitoring. Mit ihr werden individuelle genetische Profile (genetischer Fingerabdruck) erstellt, Verwandtschaftsverhältnisse und damit Rudel rekonstruiert sowie das Geschlecht bestimmt. Die Aussage z. B. „beim Individuum GW302m handelt es sich um einen im Jahr 2014 geborenen männlichen Welpen aus dem Daubitzer Rudel” erhält man primär durch die Mikrosatelliten-Analyse. Zudem bekommt man Hinweise auf Hybridisierung mit Haushunden und kann durch Merkmalsvergleiche Herkünfte aus anderen Wolfspopulationen feststellen. Das Verfahren beruht auf der Fragmentlängenanalyse (eine Standardmethode in der Wildtiergenetik). Es basiert auf der Messung von Längenunterschieden in bestimmten, hochvariablen DNA-Abschnitten der Kern-DNA. Meist werden 10 bis 20 solcher Stellen untersucht, um gut abgesicherte Ergebnisse zu erhalten. Die sichere Unterscheidung von Wolf und Hund sowie die Analyse von Hybridisierungsereignissen ist aufgrund der engen Verwandtschaft von Wolf und Hund jedoch deutlich erschwert und erfordert viel Erfahrung. Genetisch sind Haushunde eine von zahlreichen, genetisch verschiedenen Wolfspopulationen. Vergleicht man etwa die genetische Ähnlichkeit eines deutschen Wolfs mit Wölfen aus Spanien oder Russland und mit Haushunden, so wird man eine gewisse Ähnlichkeit zu den Referenzgruppen feststellen, jedoch auch erhebliche Unterschiede. Dies kann zu falschen Ergebnisinterpretationen führen und erklärt abweichende Ergebnisse zwischen Labors. Moderne Verfahren, wie sie nachfolgend erläutert werden (Punkte 3 und 4), lösen das Problem, da sie keine populationsbasierten Unterschiede messen wie die hochsensitiven Mikrosatelliten, sondern genau die Stellen in der DNA betrachten, an denen Wolf und Hund sich genetisch unterscheiden.

2. Mitchondriale Haplotyp-Bestimmung

Diese Methode ergänzt die Mikrosatelliten-Aanalyse und dient dazu, in Fällen, bei denen zu wenig DNA für ein klares Mikrosatelliten-Profil vorhanden ist, um Wolf und Haushund zu unterscheiden. Sie ist daher insbesondere für Rissuntersuchungen von großer Bedeutung, da sie häufig zu einem Ergebnis führt, bei dem kein statistisch abgesicherter genetischer Fingerabdruck (Methode 1) erhalten wird. Hybriden erkennt man mit dem Verfahren jedoch nicht, da die DNA in den Mitochondrien nur über die mütterliche Eizelle vererbt wird. Über die erhaltenen Haplotypen (eine Variante einer Nukleotidsequenz auf ein und demselben Chromosom im Genom eines Lebewesens) lassen sich ferner Aussagen zur Populationszugehörigkeit machen. Der Haplotyp „HW22“ charakterisiert z. B. Wölfe aus Italien bzw. dem Alpenraum. Die Methode basiert auf dem Ablesen von etwa 200 DNA-Bausteinen durch die DNA-Sequenzierung an einer bestimmten Stelle der mitochondrialen DNA. Die erhaltene Sequenz wird dann mit Referenzsequenzen aus der eigenen sowie ggf. den großen, im Netz öffentlich zugänglichen Gendatenbanken verglichen, um den exakten Haplotyp (= die genaue DNA-Sequenzabfolge) zu erhalten. Bei deutschen Wölfen finden sich nach Nowak Haplotyp „HW01“, seltener „HW02“ oder „HW22“.

Grafik: Dr. Carsten Nowak

Abbildung 2: Schematischer Ablauf der Rissbegutachtung durch die Fachbehörden der Länder. DNA-Analysen werden nach Bedarf bei Senckenberg beauftragt.

Die Schwarzfärbung einiger Wölfe wurde einst von Hunden vererbt.


Foto: Waitandshoot/istockphotzo.com

An einem Schafsriss wird eine Wolfsverdachts-Probe genommen.


Abbildung 3: 3 162 Proben wurden 2018/2019 (Mai bis April) analysiert. Das Diagramm zeigt eine Aufteilung nach Probenarten: Gewebe 86, Haare 145, Losung 1 030, Rissabstrich 1 804, Urin 70, Sonstige 27


Foto: Christopher Ziermann, Grafik: Dr. Carsten Nowak/Dagmar Siegel

3. SNP-Chip (Kern-DNA)

Diese Methode dient der exakten Bestimmung des Hybridisierungsgrades zwischen Wölfen und Hunden. Der Trick: Durch viele internationale Forschungsprojekte sind mittlerweile zahlreiche Genome (= gesamte DNA eines Organismus) von Hunden und Wölfen aus unterschiedlichsten Herkunftsregionen bekannt. Hieraus haben Wissenschaftler zahlreiche Stellen in der DNA herausgesucht, an denen sich nahezu alle Wölfe von Haushunden unterscheiden. Zusammen mit Partnern aus Finnland und Italien haben die Senckenberger 96 solcher Stellen auf einen kompakten DNA-Chip gepackt, mit dem sich der Hybridisierungsgrad in Wolfspopulationen nun viel genauer bestimmen lässt als z. B. mit Mikrosatelliten. Die 96 Stellen, sogenannte SNPs (= single nucleotide polymorphisms, auf Deutsch: Einzelpunktmutationen), werden bei dem Verfahren gleichzeitig an bis zu 96 Proben untersucht. Mittlerweile wurden zahlreiche solcher Chips an Wölfen aus Deutschland, Russland, Rumänien, Polen und vielen weiteren Ländern getestet. Die sichere Erkennung von Hybridisierungsereignissen wird bis in die F4-generatio ermöglicht, die der dritten Rückkreuzungsgeneration entspricht (= knapp sechs Prozent Hundeanteil). Die hohe Trennschärfe zwischen Wolf und Hund wird durch den diagnostischen Charakter der ausgewählten Merkmale erzielt (s. Abbildung 5). Eine noch höhere Auflösung ist nur durch teure und aufwendige Untersuchungen Tausender SNPs oder kompletter Genome zu erreichen. Derartige Untersuchungen laufen aktuell an mehreren Forschungseinrichtungen, etwa in Dänemark und Slowenien. Auch dort werden Wolfsproben aus Deutschland berücksichtigt.

4. Amylase-Assay (Enzym)

Diese Methode ist interessant, da sie gänzlich unabhängig von der Auswahl an Referenzproben funktioniert. Durch das Enzym Amylase lassen sich Wölfe sicher von Haushunden unterscheiden. Mittels einer sog. „Droplets Digital PCR“ wird die Anzahl an Gen-Kopien für das Stärke verdauende Enzym Amylase bestimmt. Vor einigen Jahren wurde entdeckt, dass die meisten Hunderassen mehrere Varianten des Gens tragen.

Es hat sich also seit der Domestizierung durch den Menschen als Anpassung an eine nicht ausschließlich fleischliche Ernährung entwickelt. Da Wölfe stets nur zwei Kopien dieses Merkmals tragen, Hunde jedoch ein Vielfaches davon, lassen diese sich gut voneinander unterscheiden (s. Abbildung 4). Diese Methode wird als einzige nicht direkt im Institut durchgeführt. Die Mitarbeiter fahren hierfür mit der in Gelnhausen vorbereiteten DNA ans Genetiklabor des Forschungsinstituts für Wildtierkunde und Ökologie der Veterinärmedizinischen Universität in Wien.

5. Y-Haplotypisierung (Kern-DNA)

Im Gegensatz zur mitochondrialen DNA-Haplotypisierung, bei der die mütterliche Abstammungslinie betrachtet wird, werden hier auf dem männlichen Y-Chromosom liegende, ausschließlich väterlich vererbte Hundemerkmale betrachtet. Wie der Amylase-Assay auch, wird die Methode als zusätzliches Merkmal im Rahmen der Begleitforschung zum Wolfsmonitoring angewendet. Das technische Prinzip beruht auf einer Mikrosatelliten-Analyse (Methode 1). Da Hybridisierungen zwischen Wolf und Hund meist auf der Verpaarung weiblicher Wölfe mit männlichen Hunden beruhen, tragen die meisten Hybriden zwar einen „wölfischen” mitochondrialen Haplotypen, aber das typische Y-Chromosom eines Haushundes.

Die Mitarbeiter des Senckenberg-Instituts nutzen mit den verwendeten Methoden nach eigenen Angaben die aktuell „modernsten“ Verfahren der Welt. Dennoch wird seit Jahren immer wieder von Laien und Fachleuten kontrovers über die DNA-Analysen diskutiert.

Bereits bei der Dauer der Verwendbarkeit der DNA am frischen Riss gehen die Meinungen auseinander. So besteht Uneinigkeit, ob 24 Stunden nach dem Auffinden noch taugliche DNA-Spuren vorhanden sind. Die Fachabstammungsgutachterin Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Nicole von Wurmb-Schwark von ForGen (Forensische Genetik und Rechtsmedizin am Institut für Hämatopathologie GmbH) hält nichts von starren 24-Stunden-Regelungen: „Sobald die DNA z. B. in Form von Speichel getrocknet ist, hält sie sich sehr sehr lange. Hier besteht eher die Gefahr, dassz. B. Insekten alles einfach auffressen. Und generell ist tierische DNA nicht genauso gut zu untersuchen wie menschliche, da in letzterer viel mehr Erfahrung steckt. Trotzdem kann sich auch Hunde- oder Wolfsspeichel lange halten – solange er nicht gammelt.“

Fotos: bazilfoto, LazyFocus /Istockühoto.com, Grafik: Dagmar Siegel, Quelle: Dr. Carsten Nowak

Abbildung 4: Der Amylase-Assay ist eine Methode, die ohne Referenzmaterial Wölfe von Hunden unterscheiden kann. Bei Wölfen liegen nur zwei Kopien des Enzyms Amylase vor, bei Hunden vier oder mehr.

Werden Wolfsproben aus Deutschland mit Gehegewölfen oder entfernten Wolfspopulationen verglichen, zeigen sich nur geringe prozentuale Zuordnungen zu anderen Wolfspopulationen sowie Haushunden.


Foto: Willi Rolfes

Medial sorgt jedoch vor allem die mögliche Existenz von Wolfshybriden, d. h. Mischlinge aus Verpaarungen von Wölfen und Hunden, in Deutschland für Zündstoff und Schlagzeilen. Dr. Nowak liegen bislang allerdings keinerlei Hinweise vor, dass es sich bei den deutschen Wölfen um Hybriden handelt, noch dass ein erhöhter Hybridisierungsgrad vorliegt. Der Wissenschaftler verneint die Existenz von Hybriden nicht. Der Anteil der Mischlinge liegt nach Ergebnissen des Senckenberg- Instituts bei aktuell unter einem Prozent. Dabei zweifeln Kritiker das Referenzmaterial des Senckenberg-Institus an. Die Referenzproben gelten als bedeutsam, da die DNA eines reinrassigen Wolfs von einem Hybriden genommen worden sein könnte – alle weiteren Analysen würden dann Mischlinge als rein erkennen. Nowak kontert, dass verschiedene Analyseverfahren gar nicht mehr auf Referenzmaterial angewiesen sind, z. B. über den Amylase-Assay (s. Abbildung 4).

Die Analyse menschlicher, aber auch Hunde-DNA ist für Institute wie das Hamburger ForGen, dessen Mitarbeiter seit Jahrzehnten DNA-Spuren von Tatorten untersuchen und so helfen, Verbrecher zu überführen, kein Neuland. ForGen findet bei eigenen Untersuchungen immer wieder zumindest Hinweise auf Hybriden. Auf einem Vortrag in Dortmund im Januar 2020 erklärte Frau von Wurmb-Schwark die unterschiedlichen Ergebnisse von Forschungseinrichtungen wie folgt: „Ein Computer kann nur auf die Daten zugreifen und sie auswerten, die ihm einmal eingegeben wurden. Wird bspw. Dackel-DNA unter Wolf eingespeichert, wird bei zukünftigen Anfragen zu Dackel-Proben stets Wolf als Ergebnis angezeigt.“ Je nachdem, wer was in welche Gendatenbank eingespielt hat bzw. auf welche zugegriffen wird, bestimmt das Abfrageergebnis. Die Mitarbeiter des Senckenberg-Instituts verwenden daher zum Vergleichen von Sequenzen nicht nur die eigene Gendatenbank, sondern auch die großen öffentlich zugänglichen, wissenschaftlichen Datenbanken.

Welche Sorgen die Jäger sich genau wegen der Wölfe machen, will Nowak wissen, nachdem er Methoden und Kritikpunkte an seiner täglichen Arbeit erläutert hat. Dann wiederholt er noch mal eindringlich: „Die Leute müssen einfach verstehen, dass es uns in dieser Forschungseinrichtung im Prinzip völlig egal ist, ob die Probenanalysen einen Wolf bestätigen oder nicht. Wir bearbeiten die Proben und liefern das Ergebnis an den Auftraggeber. Selbst unter den Mitarbeitern der Außenstelle wird kontrovers über die Wolfspolitik debattiert. Unser Aufgabe ist allein die DNA-Analyse und nicht Politik.“ Dass der zukünftige Umgang mit dem Wolf und möglichen Hybriden für Jäger eine entscheidende Rolle spielt, steht für ihn außer Frage. Fast geheimnisvoll fügt Nowak noch lächelnd hinzu, er plane selbst demnächst das Grüne Abitur abzulegen. Mit einem noch etwas holprig klingenden „Waidmannsheil“ verabschiedet er sich. Ein Paket voller neuer Proben ist eingetroffen. An gerissenen Tieren scheint es also in Deutschland nicht zu mangeln. In umgekehrter Richtung führt die bunte Wolfsfährte wieder sicher aus dem Institut – dem deutschen Epizentrum der Wolfsgenetik.

Abbildung 5: Ergebnis einer SNP-Chip-Analyse (Methode 3): Eine Hauptkoordinatenanalyse zeigt die genetische Abgrenzung von Wolf und Hund. Wölfe aus Deutschland sind genetisch genauso weit von Haushunden entfernt wie Wölfe aus anderen europäischen Regionen (gelb: Estland, Finnland, Polen, Rumänien). Zwischen Wolf und Haushund sind genetisch identifizierte Hybriden aus Deutschland (Sachsen 2003, Thüringen 2017) grau dargestellt.